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蔡司激光共聚焦显微镜光谱实时在线拆分模式

   01多重荧光标记的大组织样品如何做到快速、精确的信号拆分?

  由于研究细胞生物学和组织的异质性,多重荧光标记往往带来光谱重叠从而导致串色的可能。Rios博士团队寻求到一种快速高效的成像策略——配备32通道光谱检测器的蔡司激光共聚焦显微镜(点击查看),以便及时对大组织、多标记样品进行光谱拆分和成像。

共聚焦显微镜

  首先Rios博士团队从21个荧光分子中挑选出8个与光谱线性拆分软件lambda stacks相兼容的荧光基团,它们的参考发射光谱被用于蔡司online fingerprinting 实时在线拆分模式。无需单标样本的条件下,8个荧光团在单次扫描采集期间被精确拆分。相比于lambda stacks模式,蔡司online fingerprinting 实时在线拆分模式不需要存储32通道lambda数据,拆分数据量减少4倍,极大缩短拆分时间,加快下游实验分析。

  02拆分结果如何应用到多标3D厚组织样品中?

  通过测试60多种抗体以及染料,结合多重蛋白质组学和空间转录组学的最新进展,Rios博士团队选择5种早期肾脏结构的标记物,以及用于标记细胞核的DAPI,用于标记F-actin的鬼笔环肽和用于标记处于增殖周期的细胞的KI67。肾脏样品经过三轮免疫标记及透明化处理,保留细胞形态及组织架构。

  为了满足3D厚样本的多色成像,Rios博士团队借助蔡司25x/0.8 NA的长工作距离多介质物镜以及online fingerprinting 实时在线拆分模式,捕获完整3D肾脏信息的同时获取8色成像结果。蔡司共聚焦显微镜online fingerprinting 实时在线拆分模式搭配层扫Z-stacks以及拼图Tile等模块展现出获取大样本、厚组织3D数据集的优势,大大减少了采集时间、重复照明造成的光漂白以及数据预处理和存储需求。

  该方案也可以成功应用于各种组织,如人源乳腺癌的异种移植体、体外培养的乳腺癌体和源于活检的人神经系统肿瘤中。

  03哪些可训练的数据集

  有利于STAPL-3D软件开发?

  STAPL-3D 分析软件是用来从大量的3D成像数据中提取单细胞特征。为了对mLSR-3D 数据更好的分析,首先对数据进行预处理(包括阴影校正和偏差校正),减少技术背景误差。通过分割模块将数据集分割成单个细胞,并进一步将每个细胞的核与膜分割开来得到单细胞特征。

  要对数以万计的细胞进行精确、可靠的核膜分割,Rios博士团队利用蔡司Airyscan 超高分辨技术(点击查看)在样本同一位置通过25x及63x物镜获取组织3D图像结果,产生可用于深度学习的训练集。得益于Airyscan 的超高分辨(在高倍物镜下实现超分辨效果,同样兼容低倍物镜提升图像分辨率)以及同步提升图像信噪比的优势,使得对样本细微结构和弱信号进行完整解析。

  深度学习后的STAPL-3D 软件能够对细胞亚结构如细胞质,甚至是线粒体提取分子标记强度、空间信息和3D形态特征,用于大规模的重建肿瘤的空间表型特征。

  总而言之,mLSR-3D 和STAPL-3D 的联合应用揭露了之前未报告的肿瘤特异性群体,其具有独特的空间嵌入或形态学属性,展现出对肿瘤生物学新见解的潜力。

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